IgG lieferte keine Signale, puma basket heart white die auf eine Immunpräzipitationsspezifität hinweisen. Die EGFR-PUMA-Wechselwirkung wurde über Reverse IP unter Verwendung eines PUMA-Antikörpers bestätigt (Fig. S2 in Supplemental Data). Ein früherer Bericht [36] zeigte, dass EGFR im Zytoplasma in freier, nicht membrangebundener Form vorliegen kann. In diesem Zusammenhang wird aktiviertes EGFR auf der Zelloberfläche endozytiert und zum ER transportiert, wo es mit Sec61beta, einer Komponente des Sec61-Translokons, assoziiert und dann als nicht membrangebundener Rezeptor vom ER zum Zytoplasma retrotransloziert wird. [37] . Unsere Ergebnisse in Abb. S2 in Supplemental Data zeigen, dass PUMA hauptsächlich mit dem EGFR-Protein interagiert, das nicht mit Plasmamembranen assoziiert ist.
U87MG-Vektor- und U87MG-EGFRvIII-stabile Transfektantenzellen wurden 48 Stunden lang 100 ng / ml Anisomycin ausgesetzt und dem TUNEL-Assay unterzogen, um das Ausmaß der puma basket lack Apoptose zu bestimmen. Die Erzeugung und Charakterisierung der isogenen Zelllinien wurde bereits beschrieben [9]. (D) Western Blot zeigt an, dass U87MG-Vektorzellen ein sehr geringes Maß an endogenem EGFR (höheres Molekulargewicht; 175 kD) exprimieren, während U87MG-EGFRvIII-Zellen eine signifikante EGFRvIII-Expression (140 kD) puma basket platform beige enthalten -Expression von EGFRvIII in U87MG-Zellen führte zu einer signifikanten Resistenz gegen Anisomycin-induzierte Apoptose (3c, d).
Daher analysierten wir die zytoplasmatische / mitochondriale Verteilung von PUMA im isogenen Paar von U87MG-EGFRvIII- und U87MG-Vektorzellen. Die Mitochondrienfraktionierung / Western-Blotting (5a) zeigte, dass PUMA in erster Linie in den nicht mitochondrialen Fraktionen von U87MG-EGFRvIII-Zellen unter nicht belasteten Bedingungen lokalisiert war und sich nach Exposition gegenüber den apoptotischen Induktoren Staurosporin (ST) und einer moderaten mitochondrialen Translokalisierung unterzog Anisomycin (AN). Wie durch den niedrigen mtPUMA-Index (0-0,02) angezeigt, puma basket platform core ist der Großteil von PUMA in den nicht mitochondrialen Fraktionen der EGFRvIII-exprimierenden U87MGEGFRvIII-Zellen sequestriert (5a).
Im Gegensatz dazu war PUMA in U87MG-Vektorzellen mit sehr geringer EGFR-Expression ausschließlich in den mitochondrialen Fraktionen unabhängig von apoptotischem Stress vorhanden (5b). Die Wirksamkeit der Zellfraktionierung wird durch das Fehlen des cytoplasmatischen Markers ±-Tubulin in den mitochondrialen Extrakten und das Fehlen des mitochondrialen Markers Cox IV in den nichtmitochondrialen Extrakten angezeigt.
PUMA ist im Zytoplasma von EGFR- und EGFRvIII-exprimierenden GBM- und Brustkrebszellen unabhängig von apoptotischem Stress sequestriert. Das Ausmaß der mitochondrialen PUMA-Translokalisierung, mtPUMA-Index, wird wie unter Materialien und Methoden beschrieben berechnet. (A) PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma von U87MG-EGFRvIII-Zellen lokalisiert. Mit Vehikelkontrolle, Staurosporin (ST, 1 uM) oder Anisomycin (AN, 100 ng / ml) behandelte U87MG-EGFRvIII-Zellen wurden geerntet und in mitochondriale und nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert. Proteinextrakte aus beiden Fraktionen wurden einem Western Blot unterzogen, um PUMA, ±-Tubulin (cytoplasmatischer puma basket platform metallic Marker) und Cox IV (mitochondriales Protein) nachzuweisen.
PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma dieser Zellen unter unbelasteten und gestressten Bedingungen lokalisiert, was durch die niedrigen mtPUMA-Indizes angezeigt wird. Ähnliche Beobachtungen wurden auch in T98G-GBM-Zellen gefunden, die auf natürliche Weise EGFR exprimieren (5c). Der bescheidene Nachweis von mitochondrialem PUMA in diesen Zellen kann möglicherweise das Ergebnis einer unzureichenden zytoplasmatischen EGFR sein, um mit allen PUMA-Molekülen im Zytoplasma zu interagieren und diese zu sequestrieren. Wichtig ist, dass der siRNA-vermittelte Abbau der EGFR-Expression zu einem signifikanten Anstieg (16-fach) des mitochondrialen PUMA führte (Abb. 5c-links), was weiter darauf hindeutet, dass EGFR die mitochondriale PUMA-Translokalisierung modulieren kann.
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02.12.2019 06:26
